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Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

文字:[大][中][小] 2018/10/23     浏览次数:    

Long noncoding RNA lncKdm2b is required for ILC3 maintenance by initiation of Zfp292 expression

lncRNA lncKdm2b通过启动Zfp292表达来持续维持ILC3细胞

期刊Nat.Immunol.;影响因子21.809              

发表单位:中国科学院                                                           

                   


导 读

    LncKdm2b表达通过激活转录因子Zfp292促进其增殖,从而持续ILC3的维持。



摘 要

   在这项研究中,我们观察到一个不同的长非编码RNAlncKdm2b,在肠组3ILCsILC3s)中高水平表达。造血系统中的LncKdm2b缺乏导致ILC3的数量和效应功能的减少。LncKdm2b表达通过激活转录因子Zfp292促进其增殖,从而持续ILC3的维持。在机制上,lncKdm2b将染色质组织者Satb1和核重构因子(NURF)复合物募集到Zfp292启动子上以启动其转录。敲除Zfp292Bptf也减弱了ILC3的维持,导致易受细菌感染。因此,我们的研究结果表明,lncRNA可能代表ILC发展和功能的另一层调节。

 


研究背景

    ILC根据其特征效应细胞因子可分为三组,类似于CD4+辅助T细胞亚群的分类:ILC1sILC2ILC3sILC3与其他ILC一起来源于最早的祖细胞(α-LP(淋巴祖细胞)细胞,表达整合素α4β7CXCR+CLPs),其分化成受限制的常见辅助样先天淋巴祖细胞(CHILP)。下游常见ILC前体(ILCP)的特征在于转录因子PLZF的表达,并且可以产生ILC1ILC2ILC3亚组。越来越多的证据表明ILC3谱系规范是由命运决定转录因子控制的。例如,RORγt(由Rorc编码)驱动ILC3与其前体ILCP的区别。Rorc缺失导致ILC3完全丧失,但不会导致ILC1ILC2缺失。此外,芳烃受体在ILC3中以高水平表达,并且是维持ILC3所必需的。ILC3的开发和维护也需要GATA-3。然而,它调节ILC3开发和/或维护的潜在机制仍然是难以捉摸的。

 


结 果


1   LncKdm2b缺乏会损害ILC3的维护

    我们鉴定了胚胎干细胞多能性维持所需的无特征的lncRNA,我们称之为lncKdm2bLncKdm2b缺陷导致早期胚胎致死。我们观察,lncKdm2b在小鼠的固有层淋巴细胞(LPL)中以高水平组成型表达。然后,我们检测淋巴祖细胞和淋巴细胞中的lncKdm2b表达,发现ILC3群体中的高lncKdm2b表达,并通过RNA荧光原位杂交得到证实。我们通过CRISPR-Cas9技术建立了lncKdm2bflox/flox小鼠。将lncKdm2bflox/flox小鼠与Rorc-Cre小鼠杂交以从ILC3s有条件地删除lncKdm2b来生成lncKdm2bflox/floxRorc-Cre+(以下称为lncKdm2b-/-)小鼠。我们观察到,lncKdm2bflox/floxRorc-Cre-(下文中称为lncKdm2b+/+)同窝对照小鼠相比,该lncKdm2b缺失导致所有ILC3亚群的数量显著减少。我们通过原位免疫荧光染色验证了这些观察结果,表明lncKdm2b参与ILC3的维持。

 


2   lncKdm2b缺乏抑制ILC3增殖

    我们观察到的ILC3数量减少可能是由细胞死亡增加和/或细胞群扩大减少引起的。为了评估体内ILC3s的周转率,我们给小鼠施用BrdU3天,然后对来自小肠的组织进行流式细胞术以测量摄取。我们注意到来自lncKdm2b-/-小鼠的ILC3s比同窝对照小鼠的ILC3s吸收的BrdU少得多。我们接下来分离野生型和lncKdm2b缺陷的ILC3,用CFSE标记它们,并进行体内增殖测定。我们观察到与野生型ILC3相比,lncKdm2b缺陷型ILC3的增殖显著降低。类似地,lncKdm2b缺陷型ILC3Ki67+细胞的频率远低于野生型ILC3中的频率。我们观察到lncKdm2b过表达恢复了lncKdm2b缺乏-受损的增殖。然而,lncKdm2b缺陷小鼠中活性caspase-3+ILC3的百分比与野生型小鼠中的百分比相当,这表明lncKdm2b缺陷的ILC3不经历凋亡。总之,这些发现使我们得出结论,lncKdm2b调节ILC3s的增殖,但不调节细胞凋亡

 


3   lncKdm2bSatb1相关联

    我们用来自小鼠LPL裂解物的生物素标记的lncKdm2b进行RNA pull-down测定,以鉴定潜在的lncKdm2b相关蛋白。通过RNApull-down和质谱法鉴定Satb1(基因组组织蛋白)在LPL中与lncKdm2b结合。我们通过RNApull-downRNA反义纯化进一步验证了lncKdm2bSatb1的相互作用,然后进行免疫印迹分析,以及通过RNA免疫沉淀测定Satb1LPL中以高水平表达,而相关蛋白Satb2不可检测。此外,通过RNA-FISH测定显示lncKdm2bILC3细胞核中的Satb1共定位。我们通过结构域作图鉴定了相互作用位点,发现lncKdm2b的特异性片段(nt450-700)是结合Satb1蛋白所必需的。我们通过RNA电泳迁移率变动分析(RNA-EMSA)进一步验证了该lncKdm2b片段与Satb1的结合。这些结果表明lncKdm2b直接结合ILC3中的Satb1蛋白。



4   lncKdm2b激活Zfp292表达

   为了进一步确定哪些靶基因受lncKdm2b调节,我们进行了lncKdm2b+/+ILC3slncKdm2b-/-ILC3s的转录组微阵列分析。在十大下调转录因子中,我们关注的是一种未表征的转录因子Zfp292,其表达减少了五倍。我们通过实时定量PCRRT-qPCR)和免疫印迹验证了ILC3Zfp292的下调。值得注意的是,Zfp292优先在ILC3中表达。我们使用生物素标记的lncKdm2b探针通过RNA纯化(CHIRP)分析进行染色质分离。我们发现lncKdm2b沉积在Zfp292启动子的特定区域(nt-1,200-600)上。此外,我们分离了ILC3Lin-CD45loCD90hi)并进行了染色质免疫沉淀(ChIP)和DNaseI可及性测定。我们发现lncKdm2b-/-ILC3sZfp292启动子的这个区域(nt-1,200-600)在组蛋白活性标记物Lys4H3K4me3)的组蛋白H3的三甲基化中富集较少,但对于组蛋白抑制标记物H3K27me3更多。因此,lncKdm2b缺失导致Zfp292启动子上较少的RNA聚合酶II富集,因此对DNaseI消化具有更强的抗性。这些数据表明lncKdm2b激活ILC3中的Zfp292表达。

 


5   lncKdm2bSatb1NURF募集到Zfp292启动子上

    我们制备了野生型和lncKdm2b缺陷的LPL裂解物,并将它们应用于固定化的抗Satb1用于色谱法。我们通过SDS-PAGE解析洗脱的级分,然后进行银染和质谱分析。我们鉴定了lncKdm2b+/+lncKdm2b-/-LPL裂解物中的主要差异条带,如BptfSnf2l,它们是NURF染色质重塑复合物的一部分。抗-Satb1lncKdm2b+/+LPL裂解物中的NURF复合物共沉淀,但在lncKdm2b-/-LPL裂解物中不存在。lncKdm2b的加入增强了Satur1BptfNURF复合物的核心组分)之间的相互作用,而没有lncKdm2bSatb1不与Bptf结合。我们用抗Bptf进行了ChIP测定。我们发现Bptf富集在ILC3中的Zfp292启动子上。然而,lncKdm2bSatb1的缺失消除了这种现象。此外EMSA显示lncKdm2bSatb1BptfZfp292启动子区域形成复合物,而用RNaseARNaseH处理则消除了该复合物的形成。因此,Bptf缺失基本上抑制Zfp292表达,与Satb1缺陷细胞裂解物中的观察结果一致。总之,这些数据表明lncKdm2bSatb1NURF复合物募集到Zfp292启动子上以触发其表达



6   Zfp292缺乏会损害ILC3维持和功能

    我们通过CRISPR-Cas9方法建立了Zfp292缺陷型小鼠。我们发现与野生型小鼠相比,Zfp292缺失显著降低了ILC3的数量。此外,Zfp292过表达恢复了Zfp292缺失导致的ILC3增殖受损,表明Zfp292ILC3调节所必需的。值得注意的是,Satb1Bptf的缺失抑制了ILC3的增殖。在Satb1缺陷型和Bptf缺陷型小鼠的肠中,ILC3数确实减少。与野生型小鼠相比,lncKdm2b-/-Satb1-/-Bptf-/-ILC3中的Zfp292过表达拯救了ILC3增殖。更重要的是,Zfp292-/-LPL中的lncKdm2b过表达不能挽救ILC3增殖,而Zfp292+/+LPL中的lncKdm2b过表达确实促进了ILC3增殖。因此,Zfp292-/-小鼠肯定易受C.rodentium感染。最后,与其同窝野生型对照小鼠相比,lncKdm2b-/-Zfp292-/-小鼠表现出大大减少的ILC3数量,以及对细菌感染的更大易感性。总之,Zfp292在调节lncKdm2b介导的ILC3维持中起关键作用。



讨 论

    在这项研究中,我们证明lncKdm2b在肠ILC3s中以高水平表达。造血系统中的LncKdm2b敲除导致ILC3的数量和效应功能的减少。此外,我们观察到lncKdm2b不影响ILC3的发展,但确实通过促进ILC3的增殖来维持ILC3的维持。从机制上讲,lncKdm2bSatb1NURF复合物募集到Zfp292启动子上以启动其转录。Zfp292Bptf的缺失也消除了ILC3的维持,导致对啮齿类柠檬酸杆菌感染的易感性。


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